PCR引物設計應遵循哪些原則 _PCR

PCR引物設計的11條黃金法則
1.引物最好在模板cDNA的保守區內設計。DNA序列的保守區是通過物種間相似序列的比較確定的。在NCBI上搜索不同物種的同一基因，通過序列分析軟件（比如DNAman）比對（Alignment），各基因相同的序列就是該基因的保守區。
2.引物長度一般在15~30堿基之間。引物長度（primerlength）常用的是18-27bp ，但不應大于38 ，因為過長會導致其延伸溫度大于74℃ ，不適于TaqDNA聚合酶進行反應。
3.引物GC含量在40%~60%之間， Tm值最好接近72℃ 。GC含量（composition）過高或過低都不利于引發反應。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（meltingtemperature）是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下， 50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度。有效啟動溫度，一般高于Tm值5~10℃ 。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估計引物的Tm值，則有效引物的Tm為55~80℃ ，其Tm值最好接近72℃以使復性條件最佳。
【PCR引物設計應遵循哪些原則】4.引物3′端要避開密碼子的第3位。如擴增編碼區域，引物3′端不要終止于密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發生簡并，會影響擴增的特異性與效率。
5.引物3′端不能選擇A ，最好選擇T 。引物3′端錯配時，不同堿基引發效率存在著很大的差異，當末位的堿基為A時，即使在錯配的情況下，也能有引發鏈的合成，而當末位鏈為T時，錯配的引發效率大大降低， G、C錯配的引發效率介于A、T之間，所以3′端最好選擇T 。
6.堿基要隨機分布。引物序列在模板內應當沒有相似性較高，尤其是3’端相似性較高的列，否則容易導致錯誤引發（Falsepriming）。降低引物與模板相似性的一種方法是，引物中四種堿基的分布最好是隨機的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不應超過3個連續的G或C ，因這樣會使引物在GC富集序列區錯誤引發。
7.引物自身及引物之間不應存在互補序列。引物自身不應存在互補序列，否則引物自身會折疊成發夾結構（Hairpin）使引物本身復性。這種二級結構會因空間位阻而影響引物與模板的復性結合。引物自身不能有連續4個堿基的互補。兩引物之間也不應具有互補性，尤其應避免3′端的互補重疊以防止引物二聚體（Dimer與Crossdimer）的形成。引物之間不能有連續4個堿基的互補。引物二聚體及發夾結構如果不可避免的話，應盡量使其△G值不要過高（應小于4.5kcal/mol）。否則易導致產生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使PCR反應不能正常進行。
8.引物5′端和中間△G值應該相對較高，而3′端△G值較低。△G值是指DNA雙鏈形成所需的自由能，它反映了雙鏈結構內部堿基對的相對穩定性， △G值越大，則雙鏈越穩定。應當選用5′端和中間△G值相對較高，而3′端△G值較低（絕對值不超過9）的引物。引物3′端的△G值過高，容易在錯配位點形成雙鏈結構并引發DNA聚合反應。（不同位置的△G值可以用Oligo6軟件進行分析）
9.引物的5′端可以修飾，而3′端不可修飾。引物的5′端決定著PCR產物的長度，它對擴增特異性影響不大。因此，可以被修飾而不影響擴增的特異性。引物5′端修飾包括：加酶切位點；標記生物素、熒光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白質結合DNA序列；引入點突變、插入突變、缺失突變序列；引入啟動子序列等。引物的延伸是從3′端開始的，不能進行任何修飾。3′端也不能有形成任何二級結構可能。

PCR引物設計應遵循哪些原則

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