什么是引物設計原則，一起來看看小編今天的分享吧 。

step1: 引物長度一般為15-30bp ， 常用的為18-27bp，但不能大于38bp 。



step2: 引物GC含量一般為40%-60%，以45-55%為宜，上下游引物GC含量和Tm值要保持接近 。


step3: 引物所對應的模板序列的Tm值最好在72℃左右 ， 至少要在55-80℃之間，Tm值曲線以選取72度附近為
佳 ， 5'到 換段青南3’的下降形狀也有利于引物與模板的結(jié)合 。



step4: ΔG值（自由能）反應了引物與模板結(jié)合的強弱程度，3'端的ΔG值相對要低 ， 且絕對值不要超過9，否則不
利于正確引發(fā)反應，3'來自末端雙鏈的ΔG值在0--2kcal/mol時 ， PCR產(chǎn)量幾乎達到百分之百，但在-6時只達到40% ， -8
時少于20%，-10時接近于0 。


step5: 錯配率一般不要超過100 ， 否則會出現(xiàn)非目的條帶 。但對于某些特定的模板序列，還應結(jié)合比較其在正確位
點的引發(fā)效率 。如果兩者相差很大，比如在正確位點的引發(fā)效率為340以上，而在錯誤位點的引發(fā)效率為110，并且
不好找到其他更合適的引物，那么這對引物是可以接受的 。
【引物設計原則】


step6: Frq曲線為Oligo6軟件新引進的一個指標，解釋了序列片段存在的重復幾率大小，選取引物時，應該用Frq
值相對較低的片段 。


step7: 引物二聚體及發(fā)卡結(jié)構的能量的絕對值一般不要超過4.5 ， 否則容易產(chǎn)生引物二聚體而且會降低引物濃度從
而導致PCR不能正常發(fā)生 。


step8: 3'端最好不要是連續(xù)堿基，G黑機義滿葉集在既兒達百GG或CCC會導致錯誤的引發(fā)，同時3'端最后一個堿基最好不要是A或T，若
是，會導致錯配


step9: 以公式Tm=4*（G隨女背+C）+2*（A+T）-5計算Tm值 ， 也就是退火溫度 。選擇較低Tm值的引物的退火溫度為
反應的退火溫度，最好保證每個引物的Tm值相匹配，且在70-75℃范圍內(nèi) 。

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